ما هي استراتيجيات عزل البروتينات الغشائية؟
الاستخراج والذوبان: يتم تجانس مصدر البروتينات (خلايا الثدييات والأنسجة والخلايا البكتيرية وغيرها) في محلول مناسب يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، حيث يستخدم المنظف الذي يحتوي على عازلة لاستخراج البروتينات الغشائية من طبقة ثنائية الدهون، كما تتوفر أنواع مختلفة من المنظفات مثل المنظفات الأيونية والمنظفات غير الأيونية ومنظفات الأملاح الصفراوية والمنظفات (zwitterionic).
العوامل التي يجب مراعاتها عند فحص المنظفات:
من المستبعد جدًا أن يكون المنظف المنتقى الكرز أفضل بشكل موحد لجميع أنواع البروتينات الغشائية، حيث يتطلب استخراج البروتينات الغشائية من الطبقة الدهنية توازنًا دقيقًا وتعبيرًا من خلال خصائص المواد الخافضة للتوتر السطحي المختارة وجزيئات الدهون المحيطة بالبروتين، إذ يجب أن تكون قاسية بما يكفي لتعطيل الروابط بين البروتين والدهون المحيطة، ولكن خفيفة بما يكفي لترك قوى التثبيت الداخلية للبروتين دون اضطراب.
بشكل عام فإن المنظفات التي تحتوي على مجموعات رأس صغيرة مشحونة وسلاسل ألكيل أقصر نسبيًا تكون أكثر صرامة، ويمكن أن تلحق أضرارًا كبيرة ببروتين الغشاء والمنظفات الأكثر اعتدالًا نسبيًا لها سلسلة ألكيل أطول ومجموعات رأس كبيرة ومحايدة، على سبيل المثال تعتبر المنظفات الأيونية مثل SDS فعالة ولكنها تسبب تمسخًا كبيرًا للبروتين الغشائي.
يعتمد مدى الذوبان واستقرار الغشاء على نسبة المنظف: البروتين يمكن الحصول على مجمعات كبيرة تتكون من دهون الغشاء والبروتين بنسبة منخفضة (1:10) بينما مع زيادة النسبة تصبح المجمعات أصغر في الحجم، وعندما تصل من 10: 1 إلى 20: 1، يمكن الحصول على مجمعات خالية من الدهون الغشائية، ومع ذلك يجب تحسين هذه النسبة لنوع معين من البروتين.
لا يقتصر الأمر على تركيز المنظف ونوعه فحسب بل يمكن للعديد من العوامل الأخرى، بما في ذلك تركيز المخزن المؤقت ودرجة حرارة المخزن المؤقت المستخدم في صنع الأنسجة أو تجانس الخلية التأثير على استخراج البروتين الغشائي، حيث أن التركيز الأيوني للعازل هو أحد العوامل الحاسمة لذوبان بروتينات الغشاء ومن ثم يضاف ما يقرب من 150 ملي كلوريد الصوديوم في المخازن المؤقتة مع (Polyols) لتثبيت البروتينات المذابة.
الأكثر تفضيلاً هو منظم الفوسفات (تركيز يتراوح من 0.1-0.5 م) بسبب خصائصه المعروفة بتثبيت البروتين، إذ يجب تفضيل التركيزات المنخفضة من الجلسرين لتجنب اللزوجة التي قد تعيق إزالة الأملاح في التنبيذ الفائق أو على الأعمدة الكروماتوجرافية للحصول على جزء نقي من بروتينات الغشاء.
إزالة المنظفات:
أثناء عملية الاستخراج لإذابة بروتينات الغشاء يتم استخدام فائض من المنظفات والأملاح، مما قد يؤدي إلى حدوث اضطراب في التخطيط التجريبي الإضافي، ومن ثم يجب تنظيف المنظفات والأملاح لعمل مزيج نقي من بروتينات الغشاء المستخرجة، كما يمكن استخدام طرق مختلفة لتنقية بروتينات الغشاء المذابة:
غسيل الكلى: تعمل هذه الطريقة بشكل أفضل مع المنظفات التي تحتوي على قيمة تركيز عالية من الحبيبات الحرجة، ونسبة أقل من الوزن الجزيئي ومساحة المقطع العرضي للميلي، ولا يمكن استخدام هذه الطريقة إذا تم استخدام منظف منخفض القيمة مثل المنظفات غير الأيونية.
الامتزاز الكارهة للماء: يمكن أن تتصرف الراتنجات أو الحبيبات الكارهة للماء كمغناطيس للمنظفات بسبب خواصها البرمائية، وهذه طريقة مناسبة للمنظفات التي تحتوي على نسبة منخفضة من cmc.
الكروماتوغرافيا الهلامية: يمكن بسهولة فصل جزيئات المنظف عن مزيج البروتين بناءً على أحجامها باستخدام كروماتوغرافيا الهلام.
كروماتوغرافيا التبادل الأيوني: تسخر هذه الطريقة الطبيعة البرمائية لجزيئات المنظف، إذ يمكن استخدامه لإزالة المنظفات الأيونية والأيونية zwitter.
أعمدة النيكل وعلاماته: هذه طريقة مفيدة لتنقية بروتينات الغشاء التي يتم التعبير عنها بعلاماته.
يعد استخراج البروتين الغشائي مهمة صعبة للأسباب التالية: يتم التعبير عن بروتينات الغشاء بكمية منخفضة جدًا لذلك، للحصول على عائد أفضل يجب أن يتم التعبير عنهم في مضيف مناسب ومع ذلك، يمكن أن يكون الإفراط في التعبير عملاً شاقًا حيث توجد احتمالات للتجديد أو الانقطاع أو عدم الاستقرار، كما أن بروتينات الغشاء شديدة الكراهية للماء بطبيعتها مما يجعلها تشكل مجاميع في المحلول، وتعتبر بروتينات الغشاء صعبة من حيث التثبيت والحفاظ على السلامة الوظيفية والهيكلية، وهم أكثر عرضة لتحلل البروتياز لذلك تتطلب مزيدًا من الاهتمام في التثبيت.